 |
 |
п. 5.1., п. 5.2., п. 5.3., п. 5.4., п. 5.5. |  |
 |
 |
 |
В предыдущем разделе мы познакомились с тем, что такое количественная изменчивость в популяции, как она измеряется, за счет каких причин возникает. На моделях простейших популяций с ограниченным числом генотипов мы продемонстрировали, как генетическая и средовая вариативности создают вариативность фенотипическую, и выразили это основной формулой: VP = VG + VE.
Кроме того, мы выяснили, что помимо двух основных факторов -генетического и средового - на фенотипическую дисперсию влияют также факторы, обусловленные особенностями их взаимодействия (напоминаем, что имеются в виду статистические компоненты, а не реальное взаимодействие генотипа и среды в индивидуальном развитии). К компонентам, указывающим на взаимодействие генотипа и среды, относятся генотип-средовое взаимодействие и генотип-средовая ковариация (корреляция).
Когда мы записываем формулу фенотипической структуры популяции в виде суммы лишь двух компонентов - генетического и средового, - мы принимаем, что значения компонентов взаимодействия равны нулю. Если на самом деле это не так, то оценки VG и VE будут несколько искаженными. Соответственно это отразится и на значении коэффициента наследуемости, который, как мы помним, вычисляется по формуле:
h2 = VG/VF.
В реальных популяциях, где присутствуют тысячи обладателей разных генотипов, где среда постоянно варьирует, а каждый генотип реагирует на эти изменения в соответствии со своей уникальной нормой реакции, естественно, невозможно бывает непосредственно измерить такие параметры, как VG (генетическая дисперсия) и VE (средовая дисперсия). Измерению доступны лишь фенотипические особенности. Следовательно, лишь фенотипическая дисперсия (VP) может быть оценена непосредственно путем статистической обработки эмпирического материала.
Необходимо помнить, что фенотипическая дисперсия в популяции возникает в силу многих причин, каждая из которых вносит свой вклад в наблюдаемое разнообразие признаков. На какие же компоненты может быть в результате разложена фенотипическая дисперсия и как количественно оценить каждый из них?
В биометрической генетике разработаны специальные математические методы количественной оценки отдельных составляющих фенотипической дисперсии. Все они основаны на математическом моделировании и требуют основательной подготовки в области теории вероятностей, математической статистики и других разделов математики. Современному специалисту, работающему в области психогенетики, требуется также обладать достаточными знаниями и умениями в сфере компьютерных технологий, поскольку приходится иметь дело с весьма сложными пакетами программ, специально разработанными для этих целей (например, уже упоминавшийся нами ранее LISREL). В данном учебнике мы не ставим задачу научить читателей всем тонкостям математического моделирования. Постараемся объяснить лишь главные принципы. Для более глубокого знакомства с количественными методами генетики поведения можно обратиться к другим изданиям (Мазер К., Джинкс Дж., 1985; Рокицкий П.Ф., 1978; Ли Ч., 1978; Роль среды и наследственности, 1988. Гл. 1; Малых С.Б. и др., 1998. Гл. 6; Равич-Щербо И.В. и др., 1999. Гл. 8).
Основы для развития биометрической генетики были заложены еще в конце XIX в. работами Ф. Гальтона, К. Пирсона и их учеников, однако они не могли дать плодотворных результатов до той поры, пока биометрический гальтоновский подход не был соединен с генетическим - менделевским. Напомним, что в начале XX в. оба направления в генетике постоянно враждовали. Лишь после появления в 1909 г. учения В. Иогансена о чистых линиях (Хрестомат. 5.1) и публикаций в том же году работ Г. Нильсона-Эле о наследовании интенсивности окраски зерен у овса и пшеницы (Хрестомат. 5.2), стало ясно, что непрерывная количественная изменчивость может возникать за счет суммации эффектов полигенов, для каждого из которых справедливо наследование по Менделю. Дальнейшая интеграция биометрии и генетики произошла в 1918 г., когда Р. Фишер продемонстрировал, что корреляции между родственниками у человека могут объясняться в рамках менделевской концепции. Р. Фишер же предпринял первую попытку разложить непрерывную изменчивость на компоненты.
Методы математического моделирования применяются в количественной (биометрической) генетике с целью выделения непосредственно не измеряемых компонентов дисперсии. Построение любой модели обязательно включает два этапа: создание системы уравнений, формально описывающих предполагаемые соотношения между переменными, и решение этой системы уравнений, в результате чего выбирается модель, наилучшим образом соответствующая наблюдаемым данным (на английском языке этот процесс носит название model-fitting). На рис. 5.1 процесс подбора модели представлен в виде диаграммы.
Простейшая генотип-средовая модель описывается уравнением: VP = VG + VE.
В этой модели и генетическая, и средовая дисперсии также могут быть разложены на субкомпоненты.
Как уже упоминалось, в полигенных системах существуют различные эффекты взаимодействия между генами (аддитивный, доминирование, эпистаз). Рассмотрим простейший случай. Предположим, что вариативность признака определяется всего одним геном, который имеет два аллеля А и а. Следовательно, в популяции будут представлены три генотипа: гомозиготы АА и аа и гетерозиготы Аа. Пусть аллель А является усилителем, а аллель а - ослабителем. Предположим, что взаимодействие указанных аллелей носит чисто аддитивный характер. В таком случае гетерозиготы будут занимать строго промежуточное положение между гетерозиготами. Мы можем все это выразить графически (рис. 5.2).
Таким образом, при чисто аддитивном взаимодействии зависимость фенотипа от генотипа будет линейной. Если наблюдается полное доминирование, то график будет выглядеть иначе (рис. 5.3).
При доминировании не наблюдается линейной зависимости. Если присутствуют оба типа эффектов (аддитивный и доминирование), то наблюдаемые значения признака будут отличаться от теоретически ожидаемых (рис. 5.4).
Пунктиром показаны доминантные отклонения от теоретически ожидаемых значений при чисто аддитивном эффекте. Если y1= y2, то мы имеем дело с полным доминированием; если у1<y2, то имеет место неполное доминирование; если у1>у2 или у1<у0, то говорят о сверхдоминировании. Таким образом, фенотипическое значение каждого из трех генотипов можно представить как сумму двух слагаемых, первое из которых является линейной оценкой по генотипу и находится на линии регрессии, а второе представляет собой отклонение, вызванное доминированием. Аддитивному и доминантному компонентам генотипического отклонения соответствуют и два компонента генетической дисперсии: VG = VА + VD.
Таким образом, формула фенотипической структуры популяции для модели, предполагающей наличие как аддитивных эффектов, так и эффектов доминирования, может быть записана так: VP = VА + VD + VE.
Доминирование возникает при взаимодействии генов одного локуса. Если подобные эффекты имеют место для разных локусов, то говорят об эпистазе. Тогда помимо аддитивного и доминантного компонентов в предыдущую формулу можно добавить дисперсию, обусловленную эффектами эпистаза (VI), и она примет вид: VP = VА + VD + VI + VE , где VА , VD и VI есть субкомпоненты генетической дисперсии VG.
Поскольку в психогенетике основным источником информации для математического моделирования является анализ сходства и различия между родственниками, в рамках генотип-средовой модели чаще всего выделяют два основных типа средовой дисперсии. Один из них связан с возникновением различий между родственниками, другой - с формированием сходства. Эти компоненты имеют различные названия и часто по-разному обозначаются. В таблице 5.1 приведены наиболее часто встречающиеся названия и обозначения.
| Среда, формирующая различия | Среда, формирующая сходство | ||
| Название | Обозначение компонента дисперсии | Название | Обозначение компонента дисперсии |
| Случайная | VW | Систематическая | VB |
| Неразделенная (nonshared) | Ensh | Разделенная (shared) | Esh |
| Различающаяся (индивидуальная, специфическая, уникальная) | VEN VN e e2 | Общая (общесемейная) | VEC VC c c2 |
| Внутрисемейная | EW, VW | Межсемейная | EB, VB |
Большая часть психогенетических исследований имеет дело с семейными сравнениями, т.е. изучает сходство и различия между родственниками. Сходство и различия между родственниками могут возникать как в силу генетических причин, поскольку родственники имеют как общие, так и различающиеся гены (кроме однояйцовых близнецов, у которых все гены совпадают), так и в силу средовых причин, если они проживают совместно. Поэтому доступные для анализа факторы средовой дисперсии так или иначе связаны с условиями семейной и внесемейной среды, влияющей на возникновения сходства и различия родственников различных степеней родства.
Каждая семья имеет свои особенности, которые отличают ее от других семей, но являются общими для всех ее членов. Эти особенности семьи приводят к возникновению сходных черт у родственников, которые разделяют условия семейной среды. Отсюда и возникают такие названия, как общая, общесемейная, разделенная среда. Менее понятно обозначение "межсемейная", но оно означает, что это среда, которая формирует различия между семьями, но является общей для членов одной семьи. Эта среда систематически влияет на родственников, поэтому ее иногда называют систематической. К общесемейным факторам среды можно отнести все то, что С. Скарр предлагает называть различиями в возможностях (социально-экономический статус семьи): уровень достатка, жилищные условия, образование родителей, культурные традиции, особенности питания, отдыха и т.п. Например, достаток семьи определяет полноценность питания, образования, медицинского обслуживания всех членов семьи. Понятно, что чем выше экономический статус семьи, тем более обогащенную среду будут разделять дети: это различные дополнительные занятия, развивающие игры, большее количество книг в доме, компьютер, спортивный инвентарь, возможность выбора более престижного образовательного учреждения и т.д. Общая среда может разделяться родственниками не только в условиях семьи. Если дети посещают одну и ту же школу или внешкольные занятия, то там они тоже попадают в сходные средовые условия. Любые сходные ситуации, в которых оказываются члены одной семьи, могут способствовать возникновению у них сходных особенностей. Все это и относится к общей, или разделенной, среде.
До середины 80-х гг. считалось, что общая среда вносит значительный вклад в средовую изменчивость. Например, для коэффициента интеллекта вклад общей среды оценивался в 30%. Однако впоследствии выяснилось, что такая оценка характерна лишь для детского возраста и начиная с 10-11 лет постоянно уменьшается, а к 18-20 годам практически приближается к нулю. Еще меньшие значения общесемейного компонента изменчивости были получены для личностных характеристик. Как ни странно, оказалось, что у детей, растущих в одной семье, среда формирует гораздо больше различий, чем сходства (Plomin R., Daniels D., 1987).
Понятия "разделенная среда" и "семейная среда" не тождественны. В одной и той же семье родственники часто испытывают абсолютно различные средовые влияния. Дети часто отмечают, что родители по-разному относятся к каждому из них. В том числе и монозиготные близнецы, для которых более характерно совпадение оценок среды, чувствуют разное отношение к ним родителей. Даже общее экономическое положение семьи, которое определяет ее возможности, не означает полного совпадения средовых воздействий для всех членов семьи. Представим себе, что в какой-то семье собрана богатая библиотека. Корешки книг на полках, возможно, сходным образом воздействуют на зрительное восприятие родственников, но содержание книг будет одним из совпадающих средовых условий для членов семьи только в том случае, если одна и та же книга будет ими прочитана. Однако и в этом случае полного совпадения невозможно ожидать, поскольку каждый из родственников может особо обращать внимание на разные аспекты содержания. Только те элементы содержания, которые будут восприняты сходным образом каждым из родственников, могут быть отнесены к разделенной среде.
Родственники могут разделять средовые условия и вне семьи. Например, если близнецы учатся в одном и том же классе, встречаются с общими друзьями, посещают вместе внешкольные занятия, ходят в театры и на концерты, то там они тоже разделяют многие средовые условия, которые могут формировать их сходство, но эти условия нельзя назвать семейной средой. Это внесемейная разделенная среда. К сожалению, современные статистические подходы не позволяют дифференцировать общие семейные и внесемейные факторы. Поэтому понятие общая (разделенная) среда не должно приравниваться к понятию семейная среда.
Иногда, помимо двух основных средовых компонентов, в генетико-математические модели включают более специфические: общая среда, определяемая принадлежностью к одному поколению, специфическая среда сибсов, среда близнецов (разделяемая только сибсами или только близнецами) и т.п.
Теперь несколько слов о компоненте средовой дисперсии, который называется различающейся (неразделенной, индивидуальной и т.п.) средой. К этому компоненту относятся все факторы, приводящие к различиям между родственниками. Если пару десятилетий назад считалось, что родственники, живущие в одной семье, испытывают скорее сходные средовые влияния, то в последнее время эта уверенность сильно поколебалась и даже почти исчезла, поскольку появляется все больше свидетельств противоположного рода. Говоря о различающейся среде как компоненте фенотипической дисперсии, нельзя не упомянуть, что сюда же входят различия между родственниками, возникающие за счет ошибок измерений: отсюда одно из обозначений - е или е2 (от английского error - ошибка).
Теперь, познакомившись с субкомпонентами генетической и средовой дисперсии, мы можем записать исходную формулу разложения фенотипической дисперсии в более подробном виде: VP= VG + VE = ( VА + VD + VI ) + ( VB + VW ).
Это уравнение справедливо для модели, предполагающей эффекты аддитивного взаимодействия генотипа и среды. В природе гораздо чаще существуют взаимодействия гораздо более сложные. Вполне вероятно, что количественные значения признака будут меняться неравномерно при переходе из одной среды в другую, причем отдельные генотипы будут по-разному реагировать на одни и те же изменения среды. Тогда, как мы уже знаем, на фенотипическую дисперсию признака будет влиять еще один компонент - генотип-средовое взаимодействие ( VGЕ ), и уравнение разложения фенотипической дисперсии примет вид VP = ( VА + VD + VI ) + ( VB + VW ) + VGЕ.
Кроме того, при неравномерном распределении генотипов по средам имеет место генотип-средовая ковариация. Если индивиды подвергаются средовым воздействиям в соответствии со своими наследственными предрасположенностями, ковариация будет положительной и фенотипическая дисперсия увеличится. Если же среда будет действовать против наследственной предрасположенности, то появится отрицательная ковариация и фенотипическая дисперсия уменьшится. Добавим в уравнение фенотипической дисперсии компонент, соответствующий генотип-средовой ковариации, и тогда оно примет вид: VP = ( VА + VD + VI ) + ( VB + VW ) + VGЕ + 2covGE.
Приведенное только что уравнение не учитывает еще один фактор, влияющий на дисперсию фенотипов в популяции. Речь идет об ассортативности (избирательности браков), которой не всегда можно пренебречь. По некоторым признакам, по-видимому, браки заключаются совершенно случайно. Вряд ли кому-либо придет в голову искать себе партнера со сходным характером электроэнцефалограммы или отпечатков пальцев, хотя и по этим признакам, в принципе, ассортативность возможна. Однако в этом случае она будет вторичным следствием корреляции психофизиологических или морфологических особенностей с какими-либо социально-значимыми характеристиками, на которые и обращают внимание будущие супруги. Более вероятно обнаружить ассортативность, т.е. корреляцию между супругами, для некоторых важных психологических характеристик, например таких, как интеллект. В среднем корреляция супругов по коэффициенту интеллекта составляет 0,3-0,4. Однако на концах распределения - и со стороны низких, и со стороны высоких значений - уровень ассортативности повышается. Например, по данным Т.А. Думитрашку (Думитрашку Т.А., 1996; Думитрашку Т.А. и др., 1996), в группе с низким образованием и интеллектом наблюдается очень высокая ассортативность - около 0,7. При ассортативности первичной является фенотипическая корреляция супругов, корреляция же между их генотипами вторична. Высокая положительная ассортативность приводит к тому, что у потомков супругов с высокими или низкими значениями признака выше вероятность получить двойную дозу генов-усилителей или ослабителей. При положительной ассортативности генетическая дисперсия возрастает. Это является результатом вторичной (генетической) корреляции между супругами, если признак находится под контролем генов. Можно ожидать высокой ассортативности и для признаков, которые формируются в большей степени под влиянием социального окружения. Например, высокая положительная ассортативность обнаруживается для таких признаков, как религиозные убеждения, политические установки, уровень образования, социально-экономическое положение.
Теоретически можно представить себе и отрицательную ассортативность, т.е. подбор супругов по противоположным качествам. Например, можно предположить, что мужчины, склонные к полноте, будут выбирать себе худеньких спутниц жизни, и наоборот. Отрицательная ассортативность приводит к уменьшению генетической дисперсии. Однако большинство исследований указывает на то, что браки чаще всего заключаются между людьми, похожими по многим фенотипическим признакам, что означает, что исследователи чаще имеют дело с положительной ассортативностью.
Ассортативность нарушает принцип панмиксии (свободного и случайного скрещивания), лежащий в основе многих генетико-математических моделей, поэтому, если известно, что ассортативность по какому-либо признаку имеет место, в формулы фенотипических корреляций в парах родитель-ребенок добавляют определенные коэффициенты, вносящие соответствующие поправки на ассортативность (Хрестомат. 5.3). Статистически контролировать ассортативность возможно только в сложных психогенетических моделях, объединяющих несколько методов исследования, например, близнецовый и семейный.
Метод подбора моделей. Чтобы выбрать подходящую модель, адекватно описывающую изменчивость изучаемого признака в популяции, необходимо оценить соответствие модели наблюдаемым данным. В качестве эмпирических данных в психогенетике используются фенотипические значения признака у различных типов родственников. Соответствие модели проверяется с помощью статистических критериев. Если одна из моделей отвергается, проверяется следующая и т.д., пока не будет обнаружена модель, дающая наименьшее расхождение с наблюдаемыми данными. Это так называемый метод перебора моделей. Существуют различные методы получения оценок соответствия: метод невзвешенных наименьших квадратов, метод взвешенных наименьших квадратов, метод максимального правдоподобия. Более подробно познакомиться с этими методами можно в соответствующих руководствах (см. список литературы к теме). Для неспециалистов не имеет смысла погружаться в дебри математических формул - достаточно понять общую идею.
На выбор основной гипотезы о структуре фенотипической дисперсии влияют соображения простоты, здравый смысл и уже имеющиеся данные. Оптимальной считается ситуация, когда количество неизвестных меньше общего количества уравнений - избыточные уравнения дают больше степеней свободы для проверки приемлемости исходных допущений. Следует иметь в виду, что при однообразной выборке, где рассматриваются родственники одного-двух типов (например, только близнецы), сложные модели вряд ли смогут быть рассмотрены. Кроме того, важны и размеры самой выборки: чем она больше, тем легче сделать выбор между несколькими равно удовлетворительными моделями.
Чем больше различных типов родственников включено в анализ, и чем больше их общее количество (размеры выборок), тем более сложные модели могут рассматриваться и уточняться. Например, исследование обычных семей, в которых представлены только пары родителей и детей или пары сибсов, не позволяет решить основной вопрос о разделении наследственного и средового компонентов фенотипической дисперсии, поскольку семейное сходство родственников может с равным успехом возникать как за счет общих генов, так и за счет общей среды. Исследование приемных детей и разлученных родственников более перспективно, поскольку можно предположить, что среда родственников не коррелирует. Это позволяет дифференцировать наследственные и средовые компоненты. Классическое исследование пар однояйцевых и двуяйцевых близнецов также может быть использовано для разделения наследственной и средовой составляющей фенотипической изменчивости, поскольку здесь предполагается равное сходство среды при различной степени генетического сходства. Основные экспериментальные схемы психогенетики будут более подробно рассматриваться в следующей теме. Сейчас же важно понять, что соответствующие модели подбираются на основании конкретных исследований различных типов родственников, и в каждом случае имеются свои возможности и ограничения в зависимости от категорий родственников, включенных в эксперимент.
Например, близнецовый метод не позволяет оценить вклад доминирования в фенотипическую дисперсию, т.е. полную модель VP = VА + VD + VB + VW , однако трех- и двухкомпонентные модели при использовании метода близнецов вполне доступны для анализа.
Анализ путей. Одним из современных методов моделирования в психогенетике является анализ путей. Сам метод был предложен еще в 30-х гг. ХХ в. С. Райтом. Метод основан на графическом представлении причинных и корреляционных связей, или путей, между переменными, включенными в описание модели. Как правило, на диаграмме путей квадратами и кружками с прописными буквенными символами внутри обозначают наблюдаемые переменные (т.е. доступные непосредственному измерению), например фенотипические значения изучаемого признака, и так называемые латентные переменные (недоступные измерению): генотипические значения, параметры общей и различающейся среды и т.п. (рис. 5.5).
Кружки и квадраты соединяются между собой стрелками, которые обозначают предполагаемые связи между переменными. Если связь причинная, то стрелка имеет направление в одну сторону (от причины к следствию), если корреляционная - то в обе стороны, поскольку при корреляционных зависимостях не предполагается наличие причинно-следственных отношений, а лишь однонаправленность отклонений переменной от среднего. Рядом со стрелками, обозначающими пути от причины к следствию, располагаются путевые коэффициенты, а рядом со стрелками, предполагающими наличие корреляций - коэффициенты корреляции. Эти коэффициенты обозначаются соответствующими величинами (если они известны) или строчными буквами. В диаграмме путей зависимыми переменными являются те, которые подлежат объяснению (например, фенотипические характеристики), а независимыми - те, действием которых объясняются зависимые переменные и их связи (в психогенетике это чаще всего генетические и средовые параметры). Различные варианты диаграмм путей для близнецов приведены на рисунке 5.6 (а, б, в).
 |
 |
| Рис. 5.6 |
Существуют определенные правила построения и движения по путевым диаграммам, которые базируются на соответствующих статистических зависимостях. Все зависимости, выявленные с помощью метода коэффициентов путей, могут быть получены и при использовании традиционных (неграфических) статистических методов. Таким образом, метод путевого анализа, по существу, является представлением статистических зависимостей в виде диаграмм и позволяет получить такие же результаты, как и обычные методы (Хрестомат. 5.4).
Моделирование сопряженной вариативности. Генетические и средовые корреляции. В психогенетике часто возникает задача одновременного изучения не одного, а нескольких признаков, подобно тому, как это делал Г. Мендель при дигибридном скрещивании. Однако Г. Мендель имел дело с альтернативными (качественными) признаками, нас же больше интересуют количественные мультифакториальные, к которым относятся почти все психологические характеристики.
Известно, что многие психические особенности человека коррелируют между собой: это показатели вербального и невербального интеллекта, различные когнитивные характеристики и школьная успеваемость, особенности темперамента и личности и т.д. Возникает вопрос, не лежат ли за этими статистическими зависимостями зависимости причинные, определяемые сходными генетическими или средовыми механизмами реализации тех или иных психологических признаков.
Например, можно представить себе, что существуют гены, которые контролируют синтез продуктов, влияющих на скоростные процессы передачи информации в центральной нервной системе. Естественно, уровень активности таких генов будет определять множество параметров работы мозга, что неизбежно должно сказаться и на всевозможных когнитивных характеристиках. В природе широко распространено явление плейотропии, т.е. множественного действия одного и того же гена. Вполне вероятно, что эффект плейотропии является основой возникновения корреляций между признаками. Возможно, существуют и средовые причины корреляций. Например, психическая депривация в раннем детстве может послужить причиной сопряженных изменений когнитивной и личностной сферы.
Фенотипическая корреляция двух признаков может быть представлена в виде соответствующей диаграммы путей (рис. 5.7), на которой символами rG и rE обозначены соответственно генетические и средовые корреляции. Для оценки генетических и средовых корреляций в психогенетике разрабатываются соответствующие схемы исследований. Это одно из перспективных направлений в современной психогенетике, поскольку оно позволяет продвинуться в понимании происхождения не только вариативности самих фенотипов, но и их корреляции.
Структурное моделирование. Структурное моделирование представляет собой один из наиболее сложных современных методов. Применение этого метода требует соответствующей квалификации исследователя и наличия компьютерных программ, специально разработанных для этих целей (LISREL, EQS). Метод используется для анализа большого количества зависимых и независимых переменных, включенных в различные гипотезы исследования. Оценка и тестирование моделей при этом требует наличия больших выборок и современного компьютерного обеспечения. Более подробное знакомство с этим методом выходит за рамки данного учебника.
Таким образом, чтобы приступить к построению модели и ее экспериментальной проверке, необходимо иметь гипотезу об участии тех или иных факторов в формировании изменчивости изучаемого признака в популяции и спланировать эксперимент таким образом, чтобы выборки изучаемых категорий родственников соответствовали возможностям проверки адекватности предполагаемой модели. Естественно, что экспериментаторы часто не располагают достаточными ресурсами для реализации сложных экспериментальных схем, включающих многие категории родственников и рассчитанные на тысячные выборки или длительное прослеживание (лонгитюды). Например, в России в связи с существованием законов о тайне усыновления практически невозможно пользоваться методом приемных детей. Поэтому, планируя исследование, научные коллективы, - а в современной психогенетике практически невозможно выполнить исследование в одиночку, - исходят из своих возможностей, соображений здравого смысла, простоты и руководствуются требованиями, предъявляемыми математической статистикой к доказательности результатов (Хрестомат. 5.5).